Glicosilació aberrant en proteïnes de secreció com a marcadors tumorals

Als països desenvolupats, una de cada cinc persones morirà a causa del càncer. S'ha descrit que les cèl·lules canceroses presenten modificacions en els glicans presents a la superfície cel·lular i aquesta glicosilació anòmala podria reflectir-se en les glicoproteïnes de secreció. Per aquest motiu es planteja l'estudi de la glicosilació de dues proteïnes de secreció en situació normal i tumoral: la ribonucleasa pancreática humana (RNasa 1) i l'antigen prostàtic específic (PSA). La RNasa 1 és una glicoproteïna secretada majoritàriament pel pàncreas. S'ha desenvolupat un mètode immunològic per a detectar els nivells de RNasa 1 en sèrum. Malgrat la millora de la sensibilitat, respecte d'estudis anteriors, no s'han observat diferències significatives entre la concentració de RNasa 1 en sèrum de pacients control sans, afectats de neoplàsia pancreàtica, de pancreatitis o d'altres patologies. L'estudi de les estructures glucídiques de la RNasa 1, mitjançant assaigs immunològics, permet observar diferències importants en la glicosilació entre la situació normal i tumoral: Els antígens sialilats sLex i sLea només apareixen en la RNasa 1 de medi de cultiu de cèl·lules d'adenocarcinoma pancreàtic Capan-1 i MDAPanc-3 i l'antigen fucosilat Ley només apareix en la RNasa 1 de pàncreas de donant. S'ha purificat la RNasa 1 secretada per la línia MDAPanc-3, cosa que ha permès seqüenciar-ne les estructures glucídiques i comparar-les amb les de la RNasa 1 purificada del medi de les cèl·lules Capan-1 i de pàncreas de donant, corroborant els resultats abans esmentats. L'antigen prostàtic específic (PSA) és una glicoproteïna secretada principalment per la pròstata. Els seus nivells sèrics s'utilitzen actualment com a marcador del càncer de pròstata, però la seva especificitat no permet diferenciar clarament una situació benigna d'una maligna. La purificació i caracterització glucídica del PSA secretat per les cèl·lules de carcinoma prostàtic LNCaP mostren diferències molt clares amb la glicosilació que presenta el PSA purificat de plasma seminal de donant. Principalment, el PSA present en situació tumoral, purificat de les cèl·lules de carcinoma prostàtic, no conté àcid siàlic, però presenta nivells més alts de fucosilació que el PSA en situació normal. El PSA purificat de plasma seminal de donant sí que conté àcid siàlic. Aquests resultats s'han obtingut mitjançant assaigs immunològics amb detecció per lectines i s'han corroborat per seqüenciació glucídica. D'acord amb les estructures glucídiques que millor diferencien el PSA de situació normal i tumoral, s'ha portat a terme la caracterització glucídica de mostres biològiques que contenen PSA. S'han desenvolupat diferents assaigs immunològics de detecció per lectines o associats a l'activitat sialiltransferasa, amb un enriquiment previ en PSA per immunoadsorció indirecta o cromatografia per interacció tiofílica. Els resultats dels diferents assaigs permeten concloure que el PSA del sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica presenten un contingut en àcid siàlic similar al del plasma seminal de donant, encara que són lleugerament menys sialilats. Aquests resultats s'adiuen amb els determinats sobre mostres de PSA purificat. La separació del PSA per electroforesi bidimensional mostra diverses formes amb pI àcid en el PSA de plasma seminal, explicades per la presència d'àcid siàlic. Es detecten formes de pI més bàsic que el teòric per al PSA en el secretat per les cèl·lules LNCaP, que correspon a formes pPSA. Al sèrum de pacients de neoplàsia prostàtica s'hi observen formes sialilades. Les proteïnes de secreció, RNasa 1 i PSA, es troben alterades a nivell glucídic en situació tumoral, cosa que podria ser d'utilitat per a finalitats diagnòstiques.

Desenvolupament de mètodes de determinació de compostos fenòlics en aigües i sòls. Caracterització dels processos d'adsorció en diferents tipus de sòls.

El desenvolupament de mètodes d'anàlisi de compostos fenòlics és una pràctica habitual en molts laboratoris des de l'establiment de mesures legislatives de control de les concentracions d'aquestes substàncies en el medi ambient. Les tècniques cromatogràfiques representen la primera opció per a la determinació de la major part de compostos orgànics, en els que s'inclouen els fenols. Aquests, per les seves propietats de volatilitat i polaritat, poden analitzar-se emprant tant la cromatografia líquida com la cromatografia de gasos i aquesta dualitat s'ha aplicat en aquest treball.

Desenvolupament de mètodes de preconcentració emprant membranes líquides suportades i extracció en fase sòlida per a la determinació de l'herbicida glifosat i el seu metabòlit AMPA en aigües naturals

El glifosat, N-(fosfonometil) glicina, és un dels herbicides més utilitzats arreu del món a causa de la seva baixa toxicitat i al seu ampli espectre d'aplicació. A conseqüència del gran ús que se'n fa, és necessari monitoritzar aquest compost i el seu principal metabòlit, l'àcid aminometilfosfònic (AMPA), en el medi ambient. S'han descrit diversos mètodes instrumentals basats en cromatografia de gasos (GC) i de líquids (HPLC), sent aquesta darrera l'opció més favorable a causa del caràcter polar dels anàlits. Per assolir nivells de concentració baixos cal, però, la preconcentració dels anàlits. En aquest treball s'estudien diferents alternatives amb aquest objectiu. S'ha avaluat la tècnica de membrana líquida suportada (SLM) on la membrana consisteix en una dissolució orgànica, que conté un transportador (en el nostre cas, un bescanviador d'anions comercial, Aliquat 336), que impregna un suport polimèric microporós que se situa entre dues solucions aquoses: la de càrrega, que conté els anàlits inicialment, i la receptora, on es retenen els anàlits després del seu transport a través de la membrana. Les condicions d'extracció més adequades s'obtenen treballant en medi bàsic amb NaOH on els anàlits estan en forma aniònica i les majors recuperacions s'obtenen amb HCl 0,1 M o NaCl 0,5 M, la qual cosa indica que l'ió clorur és la força impulsora del transport. Un cop dissenyat el sistema, es duen a terme experiments de preconcentració amb dues geometries diferents: un sistema de membrana laminar (LSLM) on recircula la fase receptora i un sistema de fibra buida (HFSLM). Els millors resultats s'obtenen amb el mòdul de fibra buida, amb factors de concentració de 25 i 3 per a glifosat i AMPA, respectivament, fent recircular durant 24 hores 100 ml de solució de càrrega i 4 ml de solució receptora. També s'aplica una tècnica més selectiva, la cromatografia d'afinitat amb ió metàl·lic immobilitzat (IMAC), basada en la interacció entre els anàlits i un metall immobilitzat en una resina a través d'un grup funcional d'aquesta. En aquest estudi s'immobilitza pal·ladi al grup funcional 8-hidroxiquinoleïna de la resina amb matriu acrílica Spheron Oxine 1000 i s'avalua per a l'extracció i preconcentració de glifosat i AMPA. Per a ambdós anàlits l'adsorció és del 100 % i les recuperacions són superiors al 80 % i al 60 % per a glifosat i AMPA, respectivament, utilitzant HCl 0,1 M + NaCl 1 M com a eluent. Aquests resultats es comparen amb els obtinguts amb dues resines més, també carregades amb pal·ladi: Iontosorb Oxin 100, que té el mateix grup funcional però matriu de cel·lulosa, i Spheron Thiol 1000, on el grup funcional és un tiol i la matriu també és acrílica. Per al glifosat els resultats són similars amb totes les resines, però per a l'AMPA la resina Spheron Thiol és la única que proporciona recuperacions superiors al 93 %. Finalment, una altra opció estudiada és l'acoblament de dues columnes de cromatografia líquida (LC-LC). En l'estudi l'objectiu és millorar el mètode existent per a glifosat i AMPA en aigües naturals on el LOD era de 0,25 ug/l. El mètode consisteix en la derivatització precolumna amb el reactiu fluorescent FMOC i l'anàlisi amb l'acoblament LC-LC-fluorescència. Variant lleugerament les condicions de derivatització s'aconsegueix quantificar 0,1 ug/l de glifosat i AMPA. Es fortifiquen aigües naturals amb 0,1, 1 i 10 ug/l dels anàlits per validar el mètode. S'obtenen recuperacions d'entre el 85 % i el 100 %, amb desviacions estàndard relatives inferiors al 8 %. Aplicant una tècnica de preconcentració prèvia a la derivatització i anàlisi utilitzant una resina de bescanvi aniònic, Amberlite IRA-900, es millora la sensibilitat del mètode i s'assoleix un LOD per al glifosat de 0,02 ug/l.

Detecció de compostos volàtils, clorofenols, cloroanisoles i 2,4,6-tribromoanisole, relacionats amb el "gust del suro"

D'entre els defectes organolèptics associats al vi, en destaca l'anomenat "gust de suro" habitualment vinculat a la presència de cloroanisoles, els quals són productes de l'activitat microbiana formats a partir dels corresponents clorofenols. La present tesi doctoral recull, en primer lloc, metodologies analítiques adreçades principalment a la determinació dels compostos clorofenòlics (2,4,6-triclorofenol, 2,3,4,6-tetraclorofenol i pentaclorofenol) en el control de qualitat dels taps suro, emprant dissolucions hidroalcohòliques com a medi de maceració o d'extracció i utilitzant les tècniques d'extracció en fase sòlida (SPE) i microextracció en fase sòlida (SPME) acoblades a la cromatografia de gasos (GC). En segon lloc, per tal de dur a terme l'anàlisi de cloroanisoles juntament amb els seus precursors en matrius de suro s'ha avaluat un mètode basat en l'extracció amb dissolvent orgànic, el qual ha estat aplicat per a l'estudi de diferents sistemes d'eliminació d'aquests anàlits en la matriu citada. En darrer lloc, s'han proposat metodologies per l'anàlisi de mostres de vi, en les quals d'una banda s'han determinat els compostos clorofenòlics utilitzant la SPME i de l'altra el 2,4,6-tricloroanisole i el 2,4,6-tribromoanisole mitjançant l'acoblament de la SPE i la injecció de grans volums (LVI) en el sistema cromatogràfic.

New mono- and dinuclear ruthenium complexes containing the 3,5-bis(2-pyridyl)pyrazole ligand. Synthesis, characterization and applications

Se han sintetizado dos nuevos complejos mononucleares de Ru, con formula [RuCl2(Hbpp)(dmso)2], a partir de la reacción entre [RuCl2(dmso)4] y Hbpp (3,5-bis(2-piridil)pirazola). El hecho que sólo tres de los seis posibles estereoisómeros se obtengan a partir de esta reacción, se ha racionalizado en base a factores estructurales y electrónicos. Estos complejos se han caracterizado de forma estructural, espectroscópica y electroquímica. En acetonitrilo en medio básico, el isómero trans,cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2] da lugar a procesos de isomerización de enlace de un ligando dmso cuando el Ru(II) se oxida a Ru(III). Las constantes termodinámicas y cinéticas para el proceso se han determinado por voltametria cíclica. La irradiación de trans,cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2] y cis(out),cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2] con luz UV o solar da lugar a reacciones de fotosustitución de un ligando dmso por una molécula de acetonitrilo para dar un nuevo compuesto el cual ha sido caracterizado en solución por técnicas espectroscópicas y electroquímicas. Ambos complejos resultan catalizadores útiles en la transferencia de hidrógeno de isopropanol a acetofenona, obteniéndose 1-feniletanol como único producto y un 42.1% de conversión (36.1 ciclos metálicos) a 80ºC con el isómero trans,cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2], que resulta significativamente más eficaz que el complejo cis(out),cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2]. La reacción de cis(out),cis-[RuCl2(Hbpp)(dmso)2] con trpy (2,2':6',2"-terpiridina) da lugar a los dos isómeros geométricos del complejo [Ru(Hbpp)(trpy)(Cl)]+, el in y el out. Estos complejos se han aislado y caracterizado por técnicas estructurales, espectroscópicas y electroquímicas. Estos cloro complejos han sido utilizados como precursores para la síntesis de los complejos análogos con ligandos aqua (in,out-[Ru(Hbpp)(trpy)(H2O)]2+) y piridina (in,out-[Ru(Hbpp)(trpy)(py)]2+), los cuales también han sido aislados y caracterizados. Las propiedades ácido-base de los aqua complejos, y del complejo out-py se han estudiado detalladamente por voltametria cíclica y mediante valoraciones espectrofotométricas ácido-base. El tratamiento matemático de los datos así obtenidos nos ha permitido determinar los valores de pKa para los distintos equilibrios de protonación de los complejos en los estados de oxidación II y III. El complejo out-aqua ha demostrado ser un buen catalizador para la oxidación electroquímica del alcohol benzílico, presumiblemente a benzaldehido. La constante de velocidad de segundo orden para el proceso ha sido determinada como 17.1 M-1 s-1, por simulación matemática. El dímero con un puente cloro, [Ru2Cl(bpp)(trpy)2]2+ ha sido preparado por dos rutas sintéticas diferentes. El dímero análogo con un puente acetato se ha obtenido por reacción del cloro dímero con un exceso de acetato sódico. El dímero con dos ligandos aqua [Ru2(bpp)(trpy)2(OH2)2]3+ puede obtenerse por hidrólisis ácida del complejo con un acetato puente o por hidrólisis básica del complejo con un puente cloro. Estos complejos han sido caracterizados por técnicas estructurales, espectroscópicas y electroquímicas. Las soluciones del dímero con dos ligandos aqua en medio ácido resultan inestables a la coordinación de aniones de la solución con el tiempo. Las propiedades ácido-base del dímero con dos aguas coordinadas han sido estudiadas por voltametria cíclica y mediante experimentos de electrólisis a potencial controlado. El pKa para la desprotonación de uno de los ligandos aqua ha sido determinado mediante una valoración espectrofotométrica ácido-base como 6.7. Este valor tan bajo de pKa se atribuye a la formación de la entidad {Ru2O2H3}, favorable termodinámicamente. Los espectros UV-vis para los distintos estados de oxidación del aqua dímero, de RuIIRuII a RuIIIRuIV, han sido obtenidos por oxidación química y electroquímica del complejo. Se han llevado a cabo estudios cinéticos de la oxidación, paso a paso, de RuII,II a RuIV,IV , y se han determinado las constantes de oxidación de segundo orden para los distintos procesos de oxidación. La capacidad del aqua dímero en la oxidación del agua a oxígeno molecular ha sido investigada en solución homogénea utilizando CeIV como oxidante. La evolución de oxígeno se ha demostrado por cromatografia de gases. Se ha obtenido una eficiencia del 73% y 18.6 ciclos catalíticos, cuando 1.83 x 10-6 moles de dímero se han mezclado con un exceso de 100 equivalentes de cerio. El dímero con dos aguas cataliza también la oxidación del agua de forma heterogénea, con el complejo adsorbido sobre una membrana de nafion, aunque la eficiencia es menor. Se ha propuesto un mecanismo intramolecular para la reacción de oxidación del agua. Consiste en la oxidación a 4 electrones del dímero, de RuII,II a RuIV,IV, el cual reacciona con el agua para formar oxígeno y revierte nuevamente al estado de oxidación II,II. Este modelo es consistente con estudios catalíticos de la evolución de oxígeno en función de las concentraciones de cerio y catalizador, llevados a cabo en solución ácida homogénea, que demuestran que la oxidación a 4 electrones del agua se encuentra catalizada por una sola molécula de complejo bajo concentraciones elevadas de cerio. La constante de pseudo-primer-orden para la evolución de oxígeno tiene un valor de 1.4 x 10-2 s-1, que es uno de los valores de constante más elevados obtenidos hasta la fecha. Desafortunadamente, el aqua dímero se desactiva durante el proceso de catálisis dando lugar a una especie naranja, la cual estamos actualmente tratando de caracterizar.

Estudi dels carotenoides en espècies marrons de bacteris verds del sofre: diversitat, eco-fisiologia i regulació

El present treball es centra en l'estudi a diferents nivells dels carotenoides de les espècies marrons de Bacteris Verds del Sofre (GSB, de l'anglès Green Sulfur Bacteria). L'objectiu global ha estat el d'esbrinar quina és la funció d'aquests pigments dins l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes i aprofundir en el coneixement de la seva estructura i interaccions amb els altres pigments de l'aparell fotosintètic. En primer lloc es va dissenyar un nou mètode de cromatografia líquida d'alta resolució (HPLC) per analitzar de manera més ràpida i precisa els carotenoides de diferents soques de GSB (Capítol 3). Aquest mètode es basa en una purificació prèvia dels extractes pigmentaris amb columnes d'alúmina per eliminar les bacterioclorofil·les (BCls). Això va permetre analitzar amb una elevada resolució i en tan sols 45 min de carrera cromatogràfica els diferents carotenoides i els seus precursors, així com les configuracions trans i cis dels seus isòmers. El segon mètode utilitzat va consistir en una modificació del mètode de Borrego i Garcia-Gil (1994) i va permetre la separació precisa de tot tipus de pigments, procedents tant de cultius purs com de mostres de caràcter complex. Un exemple concret foren uns paleosediments de la zona lacustre de Banyoles. En aquests sediments (0,7-1,5 milions d'anys d'antiguitat) es van detectar, entre d'altres pigments, carotenoides específics de les espècies marrons de GSB, la qual cosa va permetre confirmar la presència d'aquests bacteris a la zona lacustre de Banyoles ja des del Pleistocè inferior. En aquest primer capítol també es van analitzar els carotenoides de Chlorobium (Chl.) phaeobacteroides CL1401 mitjançant cromatografia líquida acoblada a espectrometria de masses (LC-MS/MS), amb l'objectiu de confirmar la seva identificació i el seu pes molecular. A més, també es va avaluar l'efecte de la temperatura, la llum i diferents agents oxidants i reductors en la composició quantitativa i qualitativa dels carotenoides i les BCls d'aquesta espècie. Això va permetre confirmar el caràcter fotosensible de les BCls i que els isòmers trans/cis dels diferents carotenoides no són artefactes produïts durant la manipulació de les mostres, sinó que són constitutius de l'aparell fotosintètic d'aquests microorganismes. El Capítol 4 inclou els experiments de fisiologia duts a terme amb algunes espècies de GSB, a partir dels quals es va intentar esbrinar la dinàmica de síntesi dels diferents pigments de l'aparell fotosintètic (BCl antena, BCl a i carotenoides) durant el creixement d'aquestes espècies. Aquestes investigacions van permetre monitoritzar també els canvis en el nombre de centres de reacció (CR) durant el procés d'adaptació lumínica. La determinació experimental del nombre de CR es va realitzar a partir de la quantificació de la BCl663, l'acceptor primari en la cadena de transport d'electrons dels GSB. L'estimació del nombre de CR/clorosoma es va realitzar tant a partir de dades estequiomètriques i biomètriques presents a la bibliografia, com a partir de les dades experimentals obtingudes en el present treball. El bon ajust obtingut entre les diferents estimacions va donar solidesa al valor estequiomètric calculat, que fou, com a promig, d'uns 70 CR per clorosoma. En aquest capítol de fisiologia també es van estudiar les variacions en les relacions trans/cis pels principals carotenoides de les espècies marrons de GSB. Aquestes es van determinar a partir de cultius purs de laboratori i de poblacions naturals de GSB. Pel que fa als valors trobats en cultius de laboratori no es van observar diferències destacades entre el valor calculat a alta intensitat de llum i el calculat a baixa intensitat, essent en ambdós casos proper a 2. En els clorosomes aïllats de diferents soques marrons aquest quocient prengué un valor similar tant pels isòmers de l'isorenieratè (Isr) com pels del -isorenieratè (-Isr). En poblacions naturals de Chl. phaeobacteroides aquesta relació va ser també de 2 isòmers trans per cada isòmer cis, mantenint-se constant tant en fondària com al llarg del temps. Finalment, en el Capítol 5 es presenta un marcador molecular que permet la identificació específica d'espècies marrons de GSB. Malgrat que inicialment aquest marcador fou dissenyat a partir d'un gen implicat en la síntesi de carotenoides (crtY, el qual codifica per a una licopè ciclasa) la seqüència final a partir de la qual s'han aconseguit els encebadors selectius està relacionada amb la família de proteïnes de les Policètid-ceto-sintases (PKT). Tot i així, l'eina dissenyada pot ser de gran utilitat per a la discriminació d'espècies marrons de GSB respecte les verdes en poblacions mixtes com les que es troben en ambients naturals i obre la porta a futurs experiments d'ecologia microbiana utilitzant tècniques com la PCR en temps real, que permetria la monitorització selectiva de les poblacions d'espècies marrons de GSB en ecosistemes naturals.

Incidència de microorganismes i de compostos orgànics volàtils en l'aparició de defectes sensorials en suro

La incidència sobre el suro de defectes sensorials amb descriptors de florit-humitat és un dels principals problemes amb què s'enfronta la indústria surera. Els principals compostos relacionats amb aquest defecte son cloroanisoles, metoxipirazines, geosmina i metilisoborneol. Aquesta recerca s'ha fet amb l'objectiu principal d'aprofundir en els mètodes de determinació de compostos volàtils en suro. S'ha desenvolupat una metodologia basada en la microextracció en fase sòlida i la cromatografia de gasos per a l'anàlisi conjunta d'aquests compostos en macerats de suro. El fet que la majoria dels compostos d'interès tingui un origen microbià ha fet necessari completar les anàlisis químiques amb mètodes de detecció i aïllament dels microorganismes susceptibles de produir-los. S'ha utilitzat un mètode per a l'estudi de la diversitat de fongs i bacteris en mostres de suro basat en l'estudi de marcadors genètics mitjançant l'anàlisi en gradients electroforètics desnaturalitzants. Per últim s'ha avaluat la capacitat de producció de defectes sensorials per microorganismes aïllats de suro utilitzant tècniques olfactomètriques.